銷售熱線：136-5192-3355
液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）已成為許多具有挑戰(zhàn)性的分析的**分析技術(shù)，基于其選擇性，靈敏度和對(duì)不同極性化合物的廣泛適用性。盡管該技術(shù)具有優(yōu)勢(shì)，但LC-MS系統(tǒng)的復(fù)雜性常常使分析人員難以滿足方法檢測(cè)限制。在“Column Watch”的這一部分中，討論了幾種策略，通過減少污染物，仔細(xì)選擇LC方法條件以及優(yōu)化MS接口設(shè)置來提高方法靈敏度。通過了解這些參數(shù)與電離效率之間的關(guān)系，分析人員可以提高其信噪比并實(shí)現(xiàn)LC-MS技術(shù)的隱藏潛力。
在質(zhì)譜（MS）中，術(shù)語靈敏度可具有通常可互換使用的若干含義。靈敏度可定義為每單位分析物濃度變化的信號(hào)變化（例如校準(zhǔn)曲線的斜率）[1]。更常見的是，它用于參考MS檢測(cè)器中分析物產(chǎn)生的信號(hào)的大小。在后一種用法中，MS靈敏度通常用于比較檢測(cè)器。
從根本上說，檢測(cè)器提供定量數(shù)據(jù)的能力是分析物的信噪比（S / N）的函數(shù)。檢測(cè)限（LOD）由分析物S / N確定，是物質(zhì)的*低濃度，其信號(hào)可與系統(tǒng)噪聲區(qū)分開來[2]。如圖1所示，如果背景噪聲保持不變，則MS的靈敏度越高，給定方法LOD的S / N值越大。因此，通過操縱S / N可以發(fā)生靈敏度的提高。MS優(yōu)化，樣品預(yù)處理策略，流動(dòng)相組成和LC色譜柱特性都是電離效率不可或缺的，并且在優(yōu)化時(shí)會(huì)改善分析物信號(hào)。同樣，限制有助于信號(hào)抑制或加合物形成的污染物也可以增強(qiáng)響應(yīng)。
圖1 假設(shè)線性校準(zhǔn)和固定背景噪聲，假設(shè)增加靈敏度對(duì)檢測(cè)限（LOD）的影響。
MS優(yōu)化
在液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）中，靈敏度直接關(guān)系到從溶液中的分析物產(chǎn)生氣相離子的效率（電離效率）以及將它們從大氣壓轉(zhuǎn)移到MS系統(tǒng)的低壓區(qū)的能力。 （傳輸效率）[3]。電離和傳輸效率的優(yōu)化取決于LC方法參數(shù)和目標(biāo)分析物或分析物。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，有必要對(duì)MS源中發(fā)生的機(jī)制有基本的了解。
電噴霧電離（ESI）是*流行的電離技術(shù)**; 因此，它將成為本專欄文章的重點(diǎn)。然而，重要的是要注意，無論選擇何種電離模式，都必須優(yōu)化源參數(shù)。當(dāng)LC流動(dòng)相流入樣品毛細(xì)管時(shí)，基于所選擇的極性分離正離子和負(fù)離子。在正ESI中，負(fù)離子在毛細(xì)管壁上被中和，并且正離子在流動(dòng)相中繼續(xù)到毛細(xì)管**，其中帶電分析物累積成液滴。在施加電壓的影響下，形成泰勒錐[4]。靜電排斥導(dǎo)致錐體破碎成小的帶電液滴，然后，在毛細(xì)管**和采樣板之間施加的電位差的引導(dǎo)下，它朝向采樣孔行進(jìn)。隨著微小液滴向孔口前進(jìn)，溶劑在干燥氣體和熱量的作用下蒸發(fā)，導(dǎo)致液滴表面積減小，電荷密度增加。*終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為 *終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為 *終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為離子羽。
選擇合適的極性是開發(fā)靈敏的LC-MS方法的**步。選擇毛細(xì)管極性以匹配目標(biāo)分析物的電荷。通常，堿性分析物通過接受質(zhì)子（M + H）+以正離子模式*有效地電離，而酸性分析物通過提供質(zhì)子（MH）-將在負(fù)離子模式中產(chǎn)生*強(qiáng)的信號(hào)。然而，對(duì)于更復(fù)雜的分子，可能難以預(yù)測(cè)*佳極性模式。此外，分析物的行為和響應(yīng)因儀器平臺(tái)而異。因此，在初始方法開發(fā)期間或?qū)F(xiàn)有方法轉(zhuǎn)移到新儀器時(shí)，使用兩種極性模式篩選分析物是有益的[6]。
電離效率受流速，流動(dòng)相組成和目標(biāo)分析物的物理化學(xué)性質(zhì)的強(qiáng)烈影響。毛細(xì)管電壓設(shè)置取決于分析物，洗脫液和流速，并且可能對(duì)方法重現(xiàn)性產(chǎn)生重大影響。毛細(xì)管**和采樣板之間施加的電位差是維持穩(wěn)定和可重復(fù)噴霧的原因[7]。如果毛細(xì)管電壓設(shè)置不正確，可能會(huì)出現(xiàn)可變電離和精度問題。*佳霧化氣體流量和溫度也取決于洗脫液。霧化氣體限制了液滴的生長(zhǎng)，同時(shí)電荷累積并且還影響從毛細(xì)管發(fā)射的液滴的尺寸。應(yīng)增加霧化氣體流量和溫度以獲得更快的LC流速或使用高含水流動(dòng)相時(shí)。類似地，干燥氣體流量和溫度對(duì)于LC洗脫液的有效去溶劑化和氣相離子的成功生產(chǎn)是關(guān)鍵的。需要注意的是，在分析熱不穩(wěn)定分析物時(shí)，必須注意防止其在源中降解。
在電離源內(nèi)產(chǎn)生氣相離子的位置對(duì)于*佳傳輸?shù)組S系統(tǒng)是重要的。離子羽流的大小取決于發(fā)射氣相離子所需的裂變事件的數(shù)量及其與采樣孔的距離。通過基于LC流速調(diào)節(jié)毛細(xì)管**相對(duì)于孔口的位置，可以優(yōu)化離子羽流的取樣。在更快的流速下，毛細(xì)管**應(yīng)放置在離采樣孔更遠(yuǎn)的位置，以便進(jìn)行充分的去溶劑化和增加裂變事件的數(shù)量。盡管延長(zhǎng)距離將允許產(chǎn)生更多數(shù)量的氣相離子，但排斥力也將成比例地增加，導(dǎo)致離子羽流的尺寸擴(kuò)大并且氣相離子的密度減小。結(jié)果是，進(jìn)入采樣孔的離子數(shù)量會(huì)減少，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度下降[3]。在較慢的流速下，形成較小的液滴，使毛細(xì)管**更靠近取樣孔。較小的液滴更容易去溶劑化并且需要更少的裂變事件，減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。
如Szerkus及其同事分析尿液中7-甲基鳥嘌呤和葡萄糖醛酸所證明的，上述電離源參數(shù)的優(yōu)化可能會(huì)帶來2到3倍的靈敏度增益[8]。在優(yōu)化源條件時(shí)，使用預(yù)期的LC流動(dòng)相和流速非常重要。一種優(yōu)化方法是多次注入標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在每次注射時(shí)逐步改變特定的源參數(shù)。圖2展示了評(píng)估兩種農(nóng)藥*佳去溶劑化溫度的過程：甲胺磷和甲氨基阿維菌素B1a苯甲酸鹽。通過將去溶劑化溫度從400℃提高到550℃，使甲胺磷的響應(yīng)增加20％。相反，如果去溶劑化溫度超過500°C，由于該化合物的熱不穩(wěn)定性，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1a經(jīng)歷**信號(hào)損失。或者，可以通過將恒定流量的分析物引入LC洗脫液并監(jiān)測(cè)分析物TIC來優(yōu)化源條件。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。
圖2 在四次連續(xù)注射中，（a）甲胺磷和（b）甲氨基阿維菌素B1a苯甲酸酯的去溶劑化溫度的LC-MS / MS優(yōu)化。柱：100mm×2.1mm，3μm全多孔C18; 流動(dòng)相A：水+ 2mM乙酸銨+ 0.1％甲酸; 流動(dòng)相B：甲醇+ 2mM乙酸銨+ 0.1％甲酸; 梯度％B（時(shí)間）：5％（0分鐘），5％（1.5分鐘），70％（6分鐘），70％（9分鐘），100％（10分鐘），100％（12分鐘），平衡; 流速：0.5 mL / min; 極性：ESI +; 幕氣：30 psi; 霧化器氣體：45 psi; 干燥氣體：55 psi; 毛細(xì)管電壓：5.5 kV; 碰撞氣體：10 psi。
樣品預(yù)處理
樣品預(yù)處理是LC-MS分析工作流程的重要組成部分，特別是在分析含有低濃度目標(biāo)分析物的復(fù)雜樣品時(shí)。去除非目標(biāo)樣品組分可以*小化基質(zhì)干擾并改善目標(biāo)分析物的S / N比。與目標(biāo)分析物共洗脫的基質(zhì)化合物可能導(dǎo)致分析物信號(hào)的抑制或增強(qiáng); 這些干擾稱為矩陣效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)通常表現(xiàn)為MS靈敏度或特異性的損失，并且在ESI中普遍存在，因?yàn)樵诎l(fā)射氣相離子之前可能在液滴表面上發(fā)生電荷競(jìng)爭(zhēng)。作為替代方案，如果感興趣的分析物是熱穩(wěn)定的并且具有中等極性[1]，則可以使用大氣壓化學(xué)電離（APCI）。在APCI中，通過電暈針的施加電壓，LC洗脫液在電離之前**蒸發(fā)成氣體。然后電離的流動(dòng)相蒸氣與分析物分子反應(yīng)產(chǎn)生帶電離子。基質(zhì)效應(yīng)在APCI中往往不那么廣泛，因?yàn)殡x子是通過氣相反應(yīng)而不是液相反應(yīng)產(chǎn)生的[9]。
可以使用各種樣品制備策略從潛在的干擾基質(zhì)組分中提取目標(biāo)分析物。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)取決于樣品基質(zhì)，樣品體積，目標(biāo)分析物濃度和分析物理化學(xué)性質(zhì)。如果樣品清潔并且已知含有高濃度的目標(biāo)分析物，簡(jiǎn)單的過濾和稀釋是降低潛在干擾濃度的快捷方便的方法。另一方面，已知含有低目標(biāo)分析物濃度的復(fù)雜樣品將需要更嚴(yán)格的提取程序以改善信號(hào)強(qiáng)度。雖然由于需要投入的成本和時(shí)間，可能不需要更嚴(yán)格的樣品制備程序，無論選擇哪種樣品制備技術(shù)，重要的是要考慮基質(zhì)效應(yīng)可能是由于內(nèi)源性或外源性物質(zhì)的存在。盡管樣品中已存在內(nèi)源性成分（蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，色素等），但在樣品預(yù)處理過程中將外源化合物引入樣品中。這些化合物可以從用于離心管，孔板和移液管**的塑料中浸出，并且可以包括來自制造過程的副產(chǎn)物和殘余物（例如，模塑劑，增塑劑，穩(wěn)定劑和釋放劑）。污染物的數(shù)量和類型因制造商而異，如圖3a所示。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)7家制造商的聚合物固相萃取（SPE）反相96孔板提取的污染物進(jìn)行了比較。通過LC-MS分析提取物，并將得到的數(shù)據(jù)減去背景以除去溶劑和分析柱的貢獻(xiàn)。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識(shí)別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識(shí)別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。所得色譜圖的疊加顯示各制造商之間存在多種化學(xué)污染物。基于由44Da分開的一系列重復(fù)離子，在制造商C中清楚地識(shí)別聚乙二醇（PEG）的光譜（圖3b）。
圖3 用聚合物固相萃取反相96孔板用乙腈提取的污染物，并通過LC-MS / MS分析：（a）來自七個(gè)制造商的背景減去TIC的疊加。（b）從位于6.5-8分鐘的峰C收集的平均光譜。柱：100mm×2.1mm，2.7μm表面多孔C18; 流動(dòng)相A：水+ 1mM乙酸銨+ 1％乙酸; 流動(dòng)相B：甲醇; 梯度％B（時(shí)間）：5％（0分鐘），100％（8分鐘），100％（9分鐘），平衡; 流速：0.5 mL / min。[10]
液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）已成為許多具有挑戰(zhàn)性的分析的**分析技術(shù)，基于其選擇性，靈敏度和對(duì)不同極性化合物的廣泛適用性。盡管該技術(shù)具有優(yōu)勢(shì)，但LC-MS系統(tǒng)的復(fù)雜性常常使分析人員難以滿足方法檢測(cè)限制。在“Column Watch”的這一部分中，討論了幾種策略，通過減少污染物，仔細(xì)選擇LC方法條件以及優(yōu)化MS接口設(shè)置來提高方法靈敏度。通過了解這些參數(shù)與電離效率之間的關(guān)系，分析人員可以提高其信噪比并實(shí)現(xiàn)LC-MS技術(shù)的隱藏潛力。
在質(zhì)譜（MS）中，術(shù)語靈敏度可具有通常可互換使用的若干含義。靈敏度可定義為每單位分析物濃度變化的信號(hào)變化（例如校準(zhǔn)曲線的斜率）[1]。更常見的是，它用于參考MS檢測(cè)器中分析物產(chǎn)生的信號(hào)的大小。在后一種用法中，MS靈敏度通常用于比較檢測(cè)器。
從根本上說，檢測(cè)器提供定量數(shù)據(jù)的能力是分析物的信噪比（S / N）的函數(shù)。檢測(cè)限（LOD）由分析物S / N確定，是物質(zhì)的*低濃度，其信號(hào)可與系統(tǒng)噪聲區(qū)分開來[2]。如圖1所示，如果背景噪聲保持不變，則MS的靈敏度越高，給定方法LOD的S / N值越大。因此，通過操縱S / N可以發(fā)生靈敏度的提高。MS優(yōu)化，樣品預(yù)處理策略，流動(dòng)相組成和LC色譜柱特性都是電離效率不可或缺的，并且在優(yōu)化時(shí)會(huì)改善分析物信號(hào)。同樣，限制有助于信號(hào)抑制或加合物形成的污染物也可以增強(qiáng)響應(yīng)。
圖1 假設(shè)線性校準(zhǔn)和固定背景噪聲，假設(shè)增加靈敏度對(duì)檢測(cè)限（LOD）的影響。
MS優(yōu)化
在液相色譜 - 質(zhì)譜（LC-MS）中，靈敏度直接關(guān)系到從溶液中的分析物產(chǎn)生氣相離子的效率（電離效率）以及將它們從大氣壓轉(zhuǎn)移到MS系統(tǒng)的低壓區(qū)的能力。 （傳輸效率）[3]。電離和傳輸效率的優(yōu)化取決于LC方法參數(shù)和目標(biāo)分析物或分析物。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，有必要對(duì)MS源中發(fā)生的機(jī)制有基本的了解。
電噴霧電離（ESI）是*流行的電離技術(shù)**; 因此，它將成為本專欄文章的重點(diǎn)。然而，重要的是要注意，無論選擇何種電離模式，都必須優(yōu)化源參數(shù)。當(dāng)LC流動(dòng)相流入樣品毛細(xì)管時(shí)，基于所選擇的極性分離正離子和負(fù)離子。在正ESI中，負(fù)離子在毛細(xì)管壁上被中和，并且正離子在流動(dòng)相中繼續(xù)到毛細(xì)管**，其中帶電分析物累積成液滴。在施加電壓的影響下，形成泰勒錐[4]。靜電排斥導(dǎo)致錐體破碎成小的帶電液滴，然后，在毛細(xì)管**和采樣板之間施加的電位差的引導(dǎo)下，它朝向采樣孔行進(jìn)。隨著微小液滴向孔口前進(jìn)，溶劑在干燥氣體和熱量的作用下蒸發(fā)，導(dǎo)致液滴表面積減小，電荷密度增加。*終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為 *終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為 *終，排斥力克服液滴表面張力，液滴爆炸成更小的液滴。該過程重復(fù)進(jìn)行，直到液滴太小以至于發(fā)射出氣相離子[5]。形成的離子云被稱為離子羽。
選擇合適的極性是開發(fā)靈敏的LC-MS方法的**步。選擇毛細(xì)管極性以匹配目標(biāo)分析物的電荷。通常，堿性分析物通過接受質(zhì)子（M + H）+以正離子模式*有效地電離，而酸性分析物通過提供質(zhì)子（MH）-將在負(fù)離子模式中產(chǎn)生*強(qiáng)的信號(hào)。然而，對(duì)于更復(fù)雜的分子，可能難以預(yù)測(cè)*佳極性模式。此外，分析物的行為和響應(yīng)因儀器平臺(tái)而異。因此，在初始方法開發(fā)期間或?qū)F(xiàn)有方法轉(zhuǎn)移到新儀器時(shí)，使用兩種極性模式篩選分析物是有益的[6]。
電離效率受流速，流動(dòng)相組成和目標(biāo)分析物的物理化學(xué)性質(zhì)的強(qiáng)烈影響。毛細(xì)管電壓設(shè)置取決于分析物，洗脫液和流速，并且可能對(duì)方法重現(xiàn)性產(chǎn)生重大影響。毛細(xì)管**和采樣板之間施加的電位差是維持穩(wěn)定和可重復(fù)噴霧的原因[7]。如果毛細(xì)管電壓設(shè)置不正確，可能會(huì)出現(xiàn)可變電離和精度問題。*佳霧化氣體流量和溫度也取決于洗脫液。霧化氣體限制了液滴的生長(zhǎng)，同時(shí)電荷累積并且還影響從毛細(xì)管發(fā)射的液滴的尺寸。應(yīng)增加霧化氣體流量和溫度以獲得更快的LC流速或使用高含水流動(dòng)相時(shí)。類似地，干燥氣體流量和溫度對(duì)于LC洗脫液的有效去溶劑化和氣相離子的成功生產(chǎn)是關(guān)鍵的。需要注意的是，在分析熱不穩(wěn)定分析物時(shí)，必須注意防止其在源中降解。
在電離源內(nèi)產(chǎn)生氣相離子的位置對(duì)于*佳傳輸?shù)組S系統(tǒng)是重要的。離子羽流的大小取決于發(fā)射氣相離子所需的裂變事件的數(shù)量及其與采樣孔的距離。通過基于LC流速調(diào)節(jié)毛細(xì)管**相對(duì)于孔口的位置，可以優(yōu)化離子羽流的取樣。在更快的流速下，毛細(xì)管**應(yīng)放置在離采樣孔更遠(yuǎn)的位置，以便進(jìn)行充分的去溶劑化和增加裂變事件的數(shù)量。盡管延長(zhǎng)距離將允許產(chǎn)生更多數(shù)量的氣相離子，但排斥力也將成比例地增加，導(dǎo)致離子羽流的尺寸擴(kuò)大并且氣相離子的密度減小。結(jié)果是，進(jìn)入采樣孔的離子數(shù)量會(huì)減少，導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度下降[3]。在較慢的流速下，形成較小的液滴，使毛細(xì)管**更靠近取樣孔。較小的液滴更容易去溶劑化并且需要更少的裂變事件，減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。減少排斥力的影響并抑制離子羽流的大小。毛細(xì)管**和采樣孔之間的距離減小會(huì)增加離子羽流密度，提高分析物的電離效率和傳輸效率[3]。
如Szerkus及其同事分析尿液中7-甲基鳥嘌呤和葡萄糖醛酸所證明的，上述電離源參數(shù)的優(yōu)化可能會(huì)帶來2到3倍的靈敏度增益[8]。在優(yōu)化源條件時(shí)，使用預(yù)期的LC流動(dòng)相和流速非常重要。一種優(yōu)化方法是多次注入標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在每次注射時(shí)逐步改變特定的源參數(shù)。圖2展示了評(píng)估兩種農(nóng)藥*佳去溶劑化溫度的過程：甲胺磷和甲氨基阿維菌素B1a苯甲酸鹽。通過將去溶劑化溫度從400℃提高到550℃，使甲胺磷的響應(yīng)增加20％。相反，如果去溶劑化溫度超過500°C，由于該化合物的熱不穩(wěn)定性，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1a經(jīng)歷**信號(hào)損失。或者，可以通過將恒定流量的分析物引入LC洗脫液并監(jiān)測(cè)分析物TIC來優(yōu)化源條件。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。該技術(shù)允許在運(yùn)行中進(jìn)行調(diào)整。使用多種化合物的梯度洗脫方法應(yīng)通過估算洗脫時(shí)的有機(jī)物濃度來優(yōu)化。盡管這一步驟勢(shì)不可擋，但只需將工作集中在關(guān)鍵或低強(qiáng)度分析物上即可簡(jiǎn)化該過程。
|
圖3 用聚合物固相萃取反相96孔板用乙腈提取的污染物，并通過LC-MS / MS分析：（a）來自七個(gè)制造商的背景減去TIC的疊加。（b）從位于6.5-8分鐘的峰C收集的平均光譜。柱：100mm×2.1mm，2.7μm表面多孔C18; 流動(dòng)相A：水+ 1mM乙酸銨+ 1％乙酸; 流動(dòng)相B：甲醇; 梯度％B（時(shí)間）：5％（0分鐘），100％（8分鐘），100％（9分鐘），平衡; 流速：0.5 mL / min。[10]
外源化學(xué)品的其他來源包括玻璃器皿（特別是用清潔劑清潔時(shí)），非MS級(jí)溶劑和添加劑的使用，或可能從皮膚或周圍環(huán)境中引入化學(xué)品的粗心工作實(shí)踐。如果沒有適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室程序和仔細(xì)篩選樣品預(yù)處理產(chǎn)品，可能會(huì)無意中將污染物引入樣品中。如果樣品經(jīng)過濃縮步驟，可能會(huì)觀察到S / N比降低，因?yàn)榉治鑫锖臀廴疚锒紩?huì)被濃縮[9]。
流動(dòng)相組成
流動(dòng)相通過影響目標(biāo)分析物的保留和電離，在LC-MS靈敏度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。使用高純度溶劑和添加劑對(duì)于防止不需要的加合物形成和增加的MS背景是至關(guān)重要的。同樣，只有來自水凈化系統(tǒng)的超純水或適用于LC-MS的瓶裝水才能用于流動(dòng)相制備。收集的MS級(jí)和HPLC級(jí)甲醇的LC-MS譜顯示HPLC級(jí)甲醇中的雜質(zhì)顯著增加，特別是在小分子分析中常見的低分子量范圍內(nèi)（圖4）。從該數(shù)據(jù)可以明顯看出，較低等級(jí)溶劑的使用如何有助于降低靈敏度和卷積光譜，使得精確定量或光譜解釋變得困難。
圖4：HPLC級(jí)甲醇和LC-MS級(jí)甲醇的平均光譜的比較。流動(dòng)相：未指明的未改性甲醇; 流速：0.5 mL / min; 系統(tǒng)：采用ESI +電離的LC-MS; 掃描范圍：100-2000 m / z。
|
將揮發(fā)性緩沖液和酸結(jié)合到流動(dòng)相中使得能夠控制目標(biāo)分析物的電離狀態(tài)，從而可以操縱保留。分析物保留為L(zhǎng)C-MS分析人員提供了幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。首先，增加的分析物保留意味著在梯度LC期間從柱中洗脫分析物需要更高的有機(jī)溶劑濃度。已經(jīng)表明，具有較高有機(jī)濃度的液滴在MS源中更有效地去溶劑化，導(dǎo)致MS靈敏度提高[11]。其次，更高的色譜選擇性使得可以避免可能對(duì)分析物響應(yīng)有害的共洗滌基質(zhì)效應(yīng)。通過同時(shí)輸注分析物后柱，同時(shí)通過分析柱[12]進(jìn)行LC注入提取的空白基質(zhì)樣品，可以色譜監(jiān)測(cè)保留區(qū)域和基質(zhì)抑制。基質(zhì)抑制區(qū)域的特征在于分析物信號(hào)的減少。通過這種方式，可以調(diào)整分析物保留，以避免色譜圖中顯著抑制的區(qū)域。
流動(dòng)相緩沖液和酸也會(huì)影響電離效率。這種說法對(duì)于ESI尤其如此，因?yàn)橛捎陔婋x競(jìng)爭(zhēng)，它易于降低檢測(cè)器響應(yīng)。為了降低緩沖液誘導(dǎo)抑制的可能性，通常應(yīng)將濃度保持在*低限度。或者，含有甲酸的流動(dòng)相可以使不需要的金屬加合物*小化。由酸提供的質(zhì)子過量驅(qū)使大部分離子形成質(zhì)子化分子[M + H] +，導(dǎo)致響應(yīng)的總體改善，因?yàn)樗辉俜植荚诙鄠€(gè)帶電物質(zhì)上[12]。
通過在酸離子改性劑的正離子模式下提供質(zhì)子或通過在負(fù)離子模式下接受基本改性劑的質(zhì)子，觀察到電離效率的提高。后者被證明是兩種中性雌激素，雌酮和雌三醇的負(fù)電離，當(dāng)它們?cè)诤?.2％氫氧化銨的稀釋劑中制備時(shí)，與含有0.2％乙酸的雌激素相比，它們的響應(yīng)增加三倍[14]。含氨的緩沖鹽（例如，甲酸銨或乙酸銨）可以提高極性中性化合物的電離效率，所述極性中性化合物不能通過形成銨加合物而自身電離。銨鹽可用于通過提供恒定的銨供應(yīng)來防止形成不需要的加合物。例如，兩種強(qiáng)心苷的LC-MS分析，地高辛和洋地黃毒苷幾乎**用甲酸銨改性的流動(dòng)相進(jìn)行。沒有甲酸銨，這些化合物傾向于形成鈉加合物，當(dāng)通過串聯(lián)MS分析時(shí)難以破碎[14]。
LC柱特性
對(duì)提高LC-MS靈敏度的渴望趨向于使用更小的顆粒（亞2μm）和減小的柱直徑（≤2.1mm）實(shí)施**LC柱。與全多孔顆粒（FPP）相比，表面多孔顆粒（SPP）的引入允許提**率，同時(shí)降低系統(tǒng)壓力。從理論上講，**柱可以提高靈敏度; 但是，必須考慮LC-MS系統(tǒng)的柱外體積，電離效率和數(shù)據(jù)采樣率，以充分實(shí)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)。
色譜柱提供窄色譜峰的能力表征為其效率（N），并由其板高（H）定義。峰的效率是其寬度和保留時(shí)間的函數(shù)。有幾個(gè)過程有助于色譜柱內(nèi)外的峰展寬。進(jìn)樣器，連接管和檢測(cè)器都是柱外峰展寬的來源。
在色譜柱內(nèi)部，渦流擴(kuò)散（A），縱向傳質(zhì)（B）以及流動(dòng)相和固定相傳質(zhì)（C）都有助于峰的色散。總的來說，這些術(shù)語構(gòu)成了van Deemter等式：
其中h是降低板高度，v是流動(dòng)相線速度[2]。van Deemter方程作為比較柱性能的基礎(chǔ)。
提高柱效的一種方法是減小粒徑。減小總峰寬將導(dǎo)致峰高的整體增加。假設(shè)探測(cè)器噪聲保持不變，較高的峰值會(huì)導(dǎo)致S / N的改善和靈敏度的提高。此外，**峰可能更加分辨，降低了基質(zhì)干擾影響電離效率的可能性。
較小的顆粒柱還允許使用更快的*佳線速度，并且通過擴(kuò)展，更快的流速 - 不會(huì)經(jīng)歷效率的顯著損失。不幸的是，由于控制ESI的機(jī)制，更快的流速通常不利于靈敏度，因?yàn)楸仨毘ニ邢疵撘翰拍艹晒π纬蓺庀嚯x子。雖然一些制造商聲稱儀器兼容洗脫液流速高達(dá)1 mL / min，但據(jù)報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)流量LC-ESI-MS系統(tǒng)的*佳性能發(fā)生在10-300μL/ min[16]的范圍內(nèi)。為了適應(yīng)小顆粒及其相關(guān)的高線速度，2.1 mm內(nèi)徑色譜柱已成為標(biāo)準(zhǔn)流量LC-ESI-MS系統(tǒng)的**尺寸，*佳流速為200-300μL/ min。
改變顆粒形態(tài)是提高柱效的另一種方法。表面多孔顆粒與全多孔顆粒的不同之處在于它們具有圍繞實(shí)心核的薄多孔殼。它們能夠顯著提**率，因?yàn)榭v向擴(kuò)散（B）和渦流擴(kuò)散（A）的減少是由于它們的粒徑分布窄，滲透性降低和外表面粗糙[17]。圖5使用van Deemter圖比較了全多孔3-μmC18色譜柱與相同尺寸的表面多孔2.7-μmC18色譜柱的動(dòng)力學(xué)性能。與全多孔顆粒相比，表面多孔柱的效率提高了60％。
圖5：Van Deemter圖比較3-μm全多孔C18柱和2.7-μm表面多孔C18柱之間的效率。流動(dòng)相A：45％水; 流動(dòng)相B：55％乙腈; 檢測(cè)：光電二極管陣列，254 nm; 注射量：1μL; 樣品：在25:75乙腈 - 水中制備的0.03mg / mL聯(lián)苯。
|
利用內(nèi)徑較窄的色譜柱可*大限度地減少分析物稀釋，這在色譜分離過程中會(huì)發(fā)生。由于柱上稀釋，分析物靈敏度與濃度依賴性檢測(cè)器[18]的柱內(nèi)徑的平方成反比。因此，假設(shè)在兩種情況下都可以注入相同體積的樣品，理論上將2.1 mm內(nèi)徑色譜柱切換到0.3 mm內(nèi)徑色譜柱可以將靈敏度提高50倍[19]。同樣，較小的內(nèi)徑柱保持相同的線速度和降低的流速，這在電離效率方面是有益的。在這些流量下，對(duì)于需要高靈敏度且樣品量有限的應(yīng)用，使用非常慢的流速（每分鐘納升）已經(jīng)變得流行。
將**窄孔柱與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)，有幾個(gè)含義。柱內(nèi)徑的減小與效率的提高一起導(dǎo)致峰值體積的顯著降低。在不使儀器中的柱外體積*小化的情況下，柱性能將受到損害，使得難以實(shí)現(xiàn)靈敏度的任何顯著增加。大多數(shù)柱外體積貢獻(xiàn)可歸因于LC系統(tǒng)，MS貢獻(xiàn)可忽略不計(jì)。然而，發(fā)現(xiàn)用于將LC柱與MS系統(tǒng)連接的管道是關(guān)鍵的，因?yàn)樵摴艿牢挥谥螅渲胁粫?huì)發(fā)生補(bǔ)償譜帶展寬的聚焦效應(yīng)[20]。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，柱外體積不應(yīng)超過色譜圖中*窄峰的峰值體積的三分**[21]。例如，1.8μm，100 mm×2.1 mm色譜柱的峰容積約為8μL[16]。因此，*大柱外體積應(yīng)小于3μL，以抵消系統(tǒng)相關(guān)的效率損失。
較小的峰值體積也意味著需要快速采集速率來收集定量數(shù)據(jù)所需峰值的*小15-20個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。與時(shí)間相關(guān)的譜帶展寬效應(yīng)可能是由于停留時(shí)間不足和數(shù)據(jù)平滑過度造成的。在圖6中，使用三種掃描速率（300ms，50ms和5ms）分析嗎啡和氫嗎啡酮。人工展寬對(duì)于300毫秒的數(shù)據(jù)是明顯的，而5毫秒的數(shù)據(jù)顯示過度采樣的過度噪聲。不正確的停留時(shí)間設(shè)置會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量和信噪比產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。此外，在分析大量化合物時(shí)，通過在選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下收集數(shù)據(jù)可以實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，以減少與時(shí)間相關(guān)的譜帶展寬效應(yīng)的發(fā)生。
圖6 采集的數(shù)據(jù)與（a）300 ms，（b）50 ms和（c）5 ms的停留時(shí)間的比較，以及它們對(duì)時(shí)間相關(guān)頻帶展寬的貢獻(xiàn)。系統(tǒng)：LC-MS / MS; 極性：ESI +。峰值：1 =嗎啡，2 =氫嗎啡酮。
|
結(jié)論
開發(fā)靈敏且穩(wěn)健的LC-MS方法是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。為了解其目標(biāo)分析物的物理化學(xué)性質(zhì)，以及MS電離和傳輸效率的機(jī)制和局限性，分析人員可以開始做出明智的決策，以優(yōu)化總體響應(yīng)。提高靈敏度的*簡(jiǎn)單，*有效的方法是優(yōu)化電離源條件，以確保*大限度地生產(chǎn)和將氣相離子轉(zhuǎn)移到MS系統(tǒng)中。可以通過使用**、窄孔LC柱，較慢的LC流速，仔細(xì)選擇樣品預(yù)處理程序改善響應(yīng)以及減少可能導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)和基線噪音的干擾從而降低檢測(cè)限。
參考
(1) R.K. Boyd, C. Basic, and R.A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry, 1st Edition (John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, England, 2008), pp. 242, 249.
(2) L.R. Snyder, J.J. Kirkland, and J.W. Dolan, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd Edition (John Wiley & Sons, Hoboken, New Jersey, 2010), pp. 39–45, 157.
(3) J.S. Page, R.T. Kelly, K. Tang, and R.D. Smith, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1582–1590 (2007).
(4) G.I. Taylor, Proc. R. Soc. Lond. A. 280, 383 (1964).
(5) M. Wilm, Mol Cell Proteomics 10, 1–8 (2011).
(6) A. Kiontke, A. Oliveira-Birkmeier, A. Opitz, and C. Birkemeyer, PLoS One 11, 1–16 (2016).
(7) T. Taylor, LCGC Blog (7 November, 2017).
(8) O. Szerkus, A.Y. Mpanga, M.J. Markuszewski, R. Kaliszan, and D. Siluk, Spectroscopy 14, 8–16 (2016).
(9) R. Dams, M.A. Huestis, W.E. Lambert, and C.M. Murphy, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 190–1294 (2003).
(10) Y. Hua and D. Jenke, J. of Chromatogr. Sci. 50, 213-227 (2012).
(11) S.R. Needham, P.R. Brown, K. Duff, and D. Bell, J. Chromatogr. A 869, 159-170 (2000).
(12) R. Bonfiglio, R.C. King, T.V. Olah, and K. Merkle, Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 1175–1185 (1999).
(13) F. Klink, MS Solutions #3, Sepscience.com/Information/Archive/MS-Solutions.
(14) S. Lupo and T. Kahler, LCGC North America 35, 424–433 (2017).
(15) J. Boertz, X. Lu, H. Brandes, S. Squillario, D. Bell, and W. Way, Poster Session presented at the Annual Meeting of the German Society for Mass Spectrometry (DGMS), Wuppertal, Germany (2015).
(16) S. Buckenmaier, C.A. Miller, T. van de Goor, and M.M. Dittman, J. Chromatogr. A 1377, 64–74 (2015).
(17) G. Guiochon and F. Gritti, J. Chromatogr. A 1218, 1915–1938 (2011).
(18) J.P.C. Vissers, H.A. Classens, and C.A. Cramers, J. Chromatogr. A 779,1–28 (1997).
(19) J. Abian, A.J. Oosterkamp and E. Gelpi, J. Mass. Spectrom. 34, 244–254 (1999).
(20) D. Spaggiari, S. Fekete, P.J. Eugster, J. Veuthey, L. Geiser, S. Rudaz, and D. Guillarme, J. Chromatogr. A 1310, 45–55 (2013).
(21) A.J. Alexander, T.J. Waeghe, K.W. Himes, F.P. Tomasella, and T.F. Hooker, J. Chromatogr. A 1218, 5456–5469 (2011).
原文鏈接：http://www.chromatographyonline.com/lc-ms-sensitivity-practical-strategies-boost-your-signal-and-lower-your-noise?pageID=1
客服中心：400-886-1225
座機(jī)：021-66875565
手機(jī)：13651923355
郵箱：lei@guiyisci.com
地址：上海市寶山區(qū)羅寧路1288弄25號(hào)502室